山羊痘病毒通用转移载体的构建及鉴定

转移载体的构建是重组羊痘病毒构建的重要环节，在分析羊痘病毒基因组的基础上，以TK基因为插入靶序列，经PCR、酶切鉴定，获得了带有EcoRI、BamHⅠ酶切位点的TK基因片段。将此片段与经相同酶切的pUC119载体连接，构建转移载体pUC119-TK，并且以此为基础构建表达绿色荧光蛋白山羊痘病毒转移载体pTK-P7．5-GFP。将pTK-P7,5-GFP转染羊痘病毒感染的BHK21细胞，48h后报告基因得到表达，这为羊痘病毒载体系统的进一步开发奠定了基础。     

重组猪瘟病毒E2基因逆转录病毒载体的构建及其表达活性

从实验感染兔脾组织中提取总RNA，应用RT—PCR得到了CSFVC-株结构蛋白E2基因，定向克隆于逆转录病毒载体pBABEpuro，经PCR、酶切和序列分析鉴定，获取阳性重组质粒。将该重组质粒与水疱性口炎病毒载pVSV—G共转染GP2—293细胞，收获假型病毒，并在Polybrene的介导下感染PK15细胞，嘌呤霉素筛选表达猪瘟E2基因的细胞株。通过细胞传代并结合PCR、免疫荧光及ELISA检测表明，所筛的细胞细胞系能稳定表达猪瘟E2基因，而且表达产物具有良好的生物学活性。     

水貂源犬瘟热病毒F基因真核表达载体的构建及鉴定

通过T-A克隆技术,成功地构建了克隆载体PMD-18T-CDVF,用KpnI和BamHI双酶切克隆质粒PMD-18T-CDVF后,回收F基因,并将此基因定向克隆至相同双酶切回收后的pcDNA3.1真核表达载体中,获得重组质粒pcDNA3.1-CDVF。经DNA测序、限制性内切酶分析和PCR鉴定,证实成功地构建了重组质粒,从而为研究犬瘟热新型疫苗奠定了基础。     

PRRSV SD2株ORF5/ORF6基因克隆及双基因真核表达载体的构建

以PRRSV细胞培养物为模板，经RT—PCR扩增得到ORF5／ORF6基因，该产物和pIRES真核表达载体分别经双酶切，连接构建pIRES-ORF5／ORF6。经PCR、双酶切鉴定和测序证明成功构建了真核表达载体pIRES-ORF5／ORF6。测得的ORF5／ORF6序列与VR-2332株的氨基酸同源性分别为99％和100％，属北美洲型。     

口蹄疫病毒VP1基因在转基因拟南芥种子中的表达及活性检测

构建了FMDV VP1基因的种子特异性表达载体p7SBin438/VP1,在根癌农杆菌GV3101的介导下,通过浸花法转化拟南芥花序,转基因拟南芥通过卡那霉素抗性筛选后,进行了目的基因PCR扩增和ELISA检测,对ELISA筛选的阳性植株进行Western blot检测,并对转基因拟南芥后代进行了目的基因PCR分析.结果表明,种子特异性表达载体p7SBin438/VP1构建正确,FMDV结构蛋白VP1编码基因已整合进拟南芥基因组并获得表达,表达蛋白具有免疫反应活性,转基因拟南芥后代分析表明VP1基因已经遗传给后代.本试验为将FMDV免疫基因向豆科植物种子中的转化提供了依据.     

禽传染性支气管炎病毒S1基因毕赤酵母表达载体的构建

本试验根据已公布的IBV株S1基因序列及pPIC9K表达载体序列，去掉由18个氨基酸构成的信号肽后，设计一对IBV S1基因表达片段的PCR引物，利用RT—PCR扩增得到了IBV四川分离株的S1基因片段，将该片段克隆到PMD18-T载体上，通过对所得到的重组质粒进行酶切分析、菌落PCR鉴定，证明得到了含有目的基因片段的阳性重组质粒，测序分析片段长为1566bp，已经成功切除了由18个氨基酸构成的信号肽序列。将该基因亚克隆到毕赤酵母分泌型表达载体pPIC9K的SnaBⅠ和NotⅠ酶切位点，并通过菌落PCR、双酶切鉴定了该重组质粒的正确性，IBV S1基因毕赤酵母表达载体的构建为进一步利用毕赤酵母表达IBV S1蛋白提供了基础材料，并对表达产物的免疫原性和禽传染性支气管炎基因亚单位疫苗及特异性诊断抗原的研究打下了基础。     

马动脉炎病毒大囊膜糖蛋白真核表达载体的构建与瞬时表达

将马动脉炎病毒大囊膜糖蛋白基因GL插入真核表达载体pVAX1中构建真核表达载体pVAX1-GL，酶切和测序结果表明构建是正确的，用脂质体转染试剂将其转染BHK-21细胞并通过问接免疫荧光试验检测其在体外的表达情况，结果在转染的细胞表面观察到绿色荧光，证明基因得到了表达，而对照则无绿色荧光，本研究为马动脉炎基因疫苗的研究奠定了基础。     

猪带绦虫六钩蚴TSOL18真核表达载体pVTSOL18m的构建

根据Kozak原理设计引物，以重组原核表达载体pGEX—TSOL18为模板扩增TSOL18基因，用EcoRⅠ、XhoⅠ酶切后与经相同处理的pVAX1载体连接并转化JM109感受态细胞，经测序证明读码框正确后，再根据PCR点突变的方法设计引物。将目的基因NruⅠ位点中的碱基（第347位）经三次PCR反应突变，最终获得含突变位点的TSOL18m基因。EcoRI、XhoI再次酶切后与pVAX1载体连接，成功构建了含点突变的重组pVAX1表达载体，为TSOL18基因重组犬2型腺病毒活载体疫苗的研制奠定了基础。     

甜瓜果实酸性转化酶基因反义表达载体的构建(英文)

应用RNA反义技术抑制甜瓜果实发育过程中酸性转化酶活性,促进蔗糖积累,从而为培育优质品种提供了可行的新方法。将已克隆到pMD18-T载体上的甜瓜酸性转化酶基因用BamHⅠ和HincⅡ双酶切,得到该基因编码区1038bp的cDNA片段,将其定向插入到植物表达载体pROK2的BamHⅠ/SmaⅠ克隆位点,构建了甜瓜酸性转化酶cDNA反义表达载体(Anti-MAI1)。采用冻融法将其转入根癌农杆菌LBA4404,得到了完整的Ti质粒表达载体系统。利用叶盘法转化烟草,经PCR和PCR-Southern杂交检测,证明此基因已整合入烟草的核基因组中。